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   Tecnología CHIC

La tecnología CHIC (Competitive Heterologous Internal Control) es el sistema de control interno de amplificación incluido en los kits RealCycler.

Esta tecnología de desarrollo propio, permite utilizar cualquier sistema de extracción sin que se produzcan pérdidas de sensibilidad, y a la vez monitorizar con precisión una eventual inhibición de la muestra. Por ello, los kits RealCycler Monotest, RealCycler Universal y RealCycler Chic-Out son compatibles prácticamente con todos los sistemas de extracción de ADN/ARN disponibles en el mercado, sin realizar modificaciones en los protocolos originales proporcionados por el fabricante.

Control interno de amplificación

Los falsos negativos en las técnicas de detección de patógenos basadas en PCR se producen cuando algún factor impide que se genere producto de amplificación, a pesar de la presencia del patógeno en la muestra. La causa habitual es la presencia de inhibidores de la PCR, tanto componentes de la muestra clínica (hemoglobina u otras proteínas, mucopolisacáridos, urea, etc) como compuestos añadidos artificialmente durante su manipulación (heparina, EDTA, proteinasa K, polvo de los guantes de látex, etc). Dado que es una característica inherente a las muestras o a su procesamiento, las inhibiciones no pueden detectarse salvo que se utilicen sistemas de prevención específicos.

El control interno (CI) de amplificación es un sistema para la detección de los falsos negativos. Se basa en la detección paralela de un fragmento diferente al del patógeno, independientemente de la presencia o no del patógeno en la muestra y por tanto siempre debe detectarse. Está constituído por un molde de ADN o ARN y los oligonucleótidos y la sonda que permiten su detección específica. El CI puede utilizarse también para detectar problemas en la extracción del ADN o su omisión en la mezcla de amplificación. Su utilización también permite prevenir falsos positivos debidos a la amplificación de productos inespecíficos. En ausencia del ADN del agente patógeno, el CI consume el excedente de reactivo, minimizando la amplificación de secuencias no deseadas y dificultando que pueda generarse un falso positivo.

El control interno CHIC es un sistema de control interno basado en la tecnología CHIC (Competitive Heterologous Internal Control) de desarrollo propio. Esta tecnología se basa en la utilización de contrucciones artificiales de ADN heterólogo (formados por secuencias combinadas de ADN humano y de microorganismos) como molde para la detección del control interno. La principal característica de esta tecnología es que la amplificación del control interno se encuentra en desventaja competitiva respecto a la del patógeno. De esta forma no afecta a la sensibilidad del conjunto del método, y permite desarrollar sistemas altamente sensibles. Los productos RealCycler disponen de este sistema de control interno en todas sus versiones: RealCycler Monotest, RealCycler Universal-Genérico y RealCycler Chic-Out. Además, esta tecnología permite utilizar prácticamente cualquier sistema de extracción sin que se produzcan pérdidas de sensibilidad, y a la vez monitorizar con precisión una eventual inhibición de la muestra.

Características de CHIC

  • Co-amplificado en la mezcla de reacción junto a los patógenos detectados.
  • Desventaja competitiva con el patógeno = no resta sensibilidad a la detección del patógeno
  • Independiente del sistema de extraccción = compatibilidad práticamente absoluta con todos los sistemas de extracción
  • Monitorización precisa de la inhibición (ver ejemplos a continuación).

M

Muestra negativa (sin inhibición)
RESULTADO NEGATIVO VÁLIDO

Resultado:
- La señal del CHIC se detecta en el canal HEX (línea verde) con un Ct = 31,75
- El rango de aceptación del CHIC es Ct < 35. Por tanto, en este caso se encuentra dentro del mismo.
- La señal del patógeno en el canal FAM (línea azul) es plana y no marca Ct (no se detecta).

Interpretación:
Esta muestra no presenta inhibición, por lo que el resultado es claramente NEGATIVO.

Este tipo de señal se observa al utilizar agua como control negativo o muestras que presentan una ausencia absoluta de inhibidores.

Muestra negativa (con inhibición parcial)
RESULTADO NEGATIVO VÁLIDO

Resultado:
- La señal del control CHIC se detecta en el canal HEX (línea verde) con un Ct = 33,98
- El rango de aceptación del CHIC es Ct < 35. Por tanto, en este caso se encuentra dentro del mismo.
- La señal del patógeno en el canal FAM (línea azul) es plana y no marca Ct (no se detecta).

Interpretación:
La reacción no está inhibida ya que el CHIC da dentro de rango, por lo que el resultado de la muestra es NEGATIVO.

El valor del Ct de CHIC es más alto que en el caso anterior, lo que indica una inhibición parcial de la PCR. No obstante dado que se encuentra dentro del rango de aceptación el resultado puede aceptarse.

Muestra positiva (NO competencia patógeno-CHIC)
RESULTADO POSITIVO VÁLIDO

Resultado:
- La señal del patógeno se detecta en el canal FAM (línea azul) con un Ct = 30,78
- El valor del Ct CHIC = 31,1 (linea verde). Dado que hay señal en el canal FAM del patógeno, el valor de Ct CHIC es indiferente. 


Interpretación:
Muestra positiva (linea azul).
La señal de CHIC se detecta en el canal HEX (línea verde) con un Ct = 31,4 (dentro del rango de aceptación). Esto indica que no se ha producido competencia entre CHIC y el patógeno, y sugiere que el patógeno se encuentra en baja concentración.

Muestra positiva (competencia patógeno-CHIC)
RESULTADO POSITIVO VÁLIDO

Resultado:
- La señal del patógeno se detecta en el canal FAM (línea azul) con un Ct = 27,68. 

Interpretación:
Muestra positiva (independientemente del valor del CHIC).
La señal del CHIC se detecta en el canal HEX (línea verde) con un Ct = 36,38. Aunque se encuentra fuera del rango de aceptación, no indica inhibición, sino competencia entre el patógeno y el CHIC. En este caso CHIC se ha desplazado por estar en desventaja competitiva.

Muestra positiva (competencia patógeno-CHIC)
RESULTADO POSITIVO VÁLIDO

Resultado:
- La señal del patógeno se detecta en el canal FAM (línea azul) con un Ct = 24,55.

Interpretación:
Muestra positiva (independientemente del valor del CHIC).
La señal del CHIC se detecta en el canal HEX (línea verde plana). No marca Ct, lo que indica que se ha producido competencia entre el patógeno y el CHIC, y que el CHIC no se ha podido detectar por estar en desventaja competitiva. El resultado sugiere una alta concentración del patógeno.

Muestra inhibida
RESULTADO INVÁLIDO

Resultado:
La señal del CHIC en el canal HEX es plana (línea verde) y la del patógeno también (línea azul).

Interpretación:
Resultado inválido.
Esto indica una inhibición total de la reacción de amplificación y por tanto el resultado no es aceptable.